Prodotto medicinale per terapia cellulare (PMTC): cellule stromali mesenchimali. Sviluppo di un processo di produzione.

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Lenta Elisa°, Avanzini M. Antonietta * °, Croce Stefania ◊ °, Acquafredda Gloria * °, Catenacci
Laura * °, Moretta Antonia * °, Comoli Patrizia * °.

°Cell Factory, *Oncoematologia Pediatrica, ◊ Chirurgia Sperimentale. Fondazione IRCCS
Policlinico San Matteo di Pavia, Italia.

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Pubblication Date: 2019-10
Printed on: Volume 1, Special Issue - I Congresso FNO TSRM PSTRP

Introduzione

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule multipotenti, costituenti fondamentali della nicchia ematopoietica. Possono essere isolate da diversi tessuti ed espanse ex vivo per applicazioni cliniche. Per le loro proprietà immunomodulatorie, sono state utilizzate in diversi studi clinici, sia nel contesto del trapianto di cellule staminali ematopoietiche, con lo scopo di facilitare l’attecchimento e di trattare la malattia da trapianto contro l’ospite (GVHD), sia nel contesto delle malattie immunomediate/autoimmuni refrattarie alle terapie convenzionali.

Obiettivi

Sviluppare secondo Good Manufacturing Practice (GMP) un processo di produzione di PMTC/MSC idoneo all’uso clinico. Materiali e metodi: Le MSC sono isolate ed espanse da sangue midollare di donatori di cellule staminali ematopoietiche (uso allogenico) o da sangue midollare di pazienti con malattie immunomediate (uso autologo). Il processo di produzione è svolto in ambiente classificato A in un laboratorio classificato B, con atmosfera controllata e sottoposto a monitoraggio microbiologico (Cell Factory), autorizzato AIFA (n. aM- 209/2017). Le cellule mononucleate ottenute dal sangue di midollo osseo mediante separazione su gradiente di densità, sono coltivate in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco), low glucose al 5% di lisato piastrinico (Lyset TM Kit, Sclavo) che fornisce i fattori di crescita. Il terreno completo è sostituito due volte a settimana, fino alla comparsa di cloni, costituiti da cellule di forma allungata aderenti alla plastica. Al raggiungimento della confluenza, le MSC sono staccate utilizzando tripsina ricombinante (Euroclone), ripiastrate ed espanse fino al passaggio 4 (P4), considerato prodotto finale. Ad ogni tripsinizzazione le MSC sono, inoltre, criopreservate per successiva espansione. PMTC/MSC prodotto finale: il prodotto finale può essere rilasciato per uso clinico, se soddisfa i requisiti di: i) purezza, definita dalla morfologia fusiforme e dall’immunofenotipo, ii) vitalità al congelamento ≥70%, iii) identità genotipica (identità molecolare tra il materiale biologico di partenza e il PMTC e assenza di materiale genetico estraneo) iv) capacità proliferativa (cPD), v) sterilità microbiologica per aerobi, anaerobi e miceti, per endotossina batterica e per micoplasmi. Sterilità ambientale: In Cell Factory sono previsti controlli ambientali in ogni fase della lavorazione. In particolare, vengono eseguite conte particellari in continuo in classe A e B e campionamenti microbiologici dell’aria, delle strumentazioni, dei materiali e reagenti e degli operatori. Tracciabilità: L’intero processo produttivo è tracciato mediante l’impiego di due software (Biomanagement e Cryomanagement, SOL-Prometeo). Biomanagement permette di creare una anagrafica del donatore/paziente, di codificare il materiale biologico di partenza e di documentare i passaggi dell’intero processo produttivo. Cryomanagement gestisce la banca dei prodotti criopreservati, generando mappe di stoccaggio in cui ogni campione è identificato in modo univoco da un
codice a barre.

Risultati e conclusioni

Dallo sviluppo del PMTC abbiamo espanso: i) 6 lotti di MSC per uso allogenico, da cui 35 sottolotti espansi, ottenendo 3.9×10 9 MSC prodotto finale. Inoltre sono stati criopreservati per successiva espansione: 7.65×10 8 MSC a P1, 1.3×10 9 a P2 e 1.3×10 9 a P3; ii) 3 lotti di MSC per uso autologo, da cui 14 sottolotti espansi, ottenendo 1.5×10 9 MSC prodotto finale. Criopreservati per successiva espansione: 1.4×10 8 a P1, 3.5×10 8 a P2 e 3.8×10 8 a P3. Tutti i prodotti finali sono risultati conformi ai requisiti stabiliti per il rilascio, compresa la sterilità microbiologica ed ambientale. In conclusione, il processo di produzione che abbiamo sviluppato in Cell Factory, permette di ottenere un PMTC idoneo all’ uso clinico sia per il numero di cellule che riusciamo ad ottenere, permettendo il trattamento di pazienti pediatrici e adulti, sia per la conformità ai requisiti richiesti dalle GMP.